O1. The first objective is to optimize the modification protocols of PiPOx with doxorubicin to obtain derivatives with a balanced functionalization degree and adequate solubility in water. (TRL 3)

O2. The second objective is to test and validate the stability and cytotoxicity of PiPOx polymer and PiPOx-DOX conjugates. (TRL 3)

O3. The third objective is to investigate the interaction of the PiPOx-DOX conjugates with tumor cell (drug/conjugate internalization/localization, cytotoxic effect, and ICD signs). (TRL 3)

O4. The fourth objective is to define the optimal formulation of the new polymer-drug conjugate and demonstrate its efficiency for chemo-immunotherapy (proof-of-concept). (TRL 4)

Project leader:

Dr. Ing. Valentin Victor Jerca

Email: victor_jerca@yahoo.com, victor.jerca@ccocdn.ro

 

Partner responsible:

Dr. Ing. Diana Elena Giol

Email: diana_giol@yahoo.com

 

Postdoctoral members:

Dr. Ing. Florica Adriana Jerca

Email: adriana_jerca@yahoo.com, adriana.jerca@ccocdn.ro

Dr. Ing. Doriana Nicoleta Banu

Email: doriana.banu@yahoo.com, doriana.banu@ccocdn.ro

 

Senior researchers:

Dr. Ing. Dumitru Mircea Vuluga

Dr. Ivan Petru Filip

 

Phd. Student

Emilian Ghibu

 

Tehnicians

Albu Valerica

Mariana Balea

Doinita Pasalega

Teodora Valcu

Rezumat Etapa 1/2020

Au fost sintetizati 6 polimeri PiPOx de diferite mase moleculare prin polimerizare anionica, folosind protocolul deja raportat de grupul nostru. Polimerii au fost caracterizati prin spectroscopie de RMN de proton pentru a determina structura chimica si prin cromatografie de excluziune sterica (SEC) pentru a determina masa moleculara si distributia. Polimerii au fost trimisi la partener pentru studii de citotoxicitate.

Activitatea 1.1 Dezvoltarea sintetica a precursorului pentru legarea DOX a fost realizata.

 

Rezumat Etapa 2/2021

S-a investigat stabilitatea PiPOx in diverse medii apoase. Astfel, s-a constatat ca PiPOx este stabil in apa timp de doua luni, prezinta stabilitate buna in mediu bazic (de la 2 pana la 3 saptamani), prezinta stabilitate moderata in conditii neutre (5 zile) si are o stabilitate slaba in conditii acide (de ordinul a cateva ore) pana la debutul unui proces de degradare a inelului oxazilinic.

In contextul aplicatiilor biomedicale, PiPOx a fost investigat si in medii simulate ale corpului, cum ar fi: fluid corporal simulat (SBF si PBS), saliva simulata (SSa), fluid intestinal simulat (SIF), plasma si fluid gastric simulat (SGF). In toate aceste fluide simulate cu un pH cuprins intre 6.4 si 7.4 PiPOx prezinta o stabilitate chimica constanta de 5 zile, cu exceptia SGF (pH 1.2). La pH 1,2, unitatile de iPOx din catena laterala sunt transformate intr-o structura de tip poli(N-(2-hidroxietil)metacrilamida solubila in apa pe parcursul a 2 saptamani de incubare la 37 °C.

Testele de degradare ale PiPOx in medii apoase simple si fluide corporale simulate au fost efectuate pentru a determina performanta acestui polimer in dezvoltarea de conjugate polimerice, pentru aplicatii injectabile. Intervalul de stabilitate in aceste fluide corporale demonstreaza potentialul polimerului PiPOx de a fi utilizat in dezvoltarea sistemelor de livrare a medicamentelor, inclusiv pentru administrarea intravenoasa a medicamentelor.

Conjugatele polimerice cu doxorubicina (DOX) au fost sintetizate cu succes prin reactii de post-modificare ale PiPOx. Astfel in prima etapa s-a modificat PiPOx cu 2-mercaptopropionat de etil. In cea de-a doua etapa a avut loc hidrazinoliza gruparilor esterice urmata de reactia cu DOX. Intermediarii de reactie si compusii finali au fost caracterizati prin spectroscopie FTIR, H-RMN si UV-Vis. Interactia conjugatele polimerice obtinute cu celule tumorale urmeaza sa fie studiata in etapa urmatoare.

 

Partener 1

Polimerii PiPOx prezinta o viabilitate celulara relativa de peste 70% pe celule fibroblaste murine L929, la concentratii pana la 40 mg/mL, indicand non-citotoxicitatea materialelor. Citokinele proinflamatorii TNF-alfa au prezentat concentratii similare intre PiPOx55 si PEG de masa moleculara mica si mare (3,35kDa si respectiv 35 kDa), dupa stimularea celulelor macrofage RAW267.4. Citokinele proinflamatorii IL-6 au prezentat concentratii semnificativ mai mari in cazul stimularii cu PEG, comparativ cu PiPOx55 dupa stimularea celulelor macrofage RAW267.4

Activitate 2.1 Dezvoltarea sintetica a precursorilor si a polimerilor (PiPOx) a fost efectuata.

Activitate 2.2 Dezvoltarea sintetica a conjugatelor de PiPOx-DOX este in curs de perfectionare.

Activitate 2.3 Testarea in vitro a stabilitatii, a eliberarii de medicament si studii de citotoxicitate a materialelor au fost efectuate.

Activitate 2.4 Studii de interactie a conjugatelor PiPOx-DOX cu celule tumorale se afla in derulare.

Activitate 2.5 Inducerea ICD se afla in derulare.

Activitate 2.6 Diseminare si participare la manifestari tehnico-stiintifice efectuata cu succes.

 

Rezumat Etapa 3/2022

În cadrul echipei coordonatorului au fost optimizate protocoalele de obținere a conjugatelor de PiPOx-DOX. Conținutul de doxorubicină a fost optimizat astfel încât să se obțină conjugate polimerice solubile în apă. Conjugatele polimerice cât și intermediarii obținuți au fost purificați și caracterizați prin spectroscopie FTIR, H-RMN și UV-Vis.

S-au efectuat studii de reproductibilitate pentru verificarea corectitudinii rezultatelor și de ridicare la scară a sintezelor pentru avansarea de eșantioane de polimeri PiPOx și conjugate PiPOx-DOX către Partenerul 1 pentru testarea stabilității hidrolitice, a citotoxicității, hemocompatibilității, biodistribuției, a interacției cu celulele tumorale și a inducerii de moarte celulară.

 

Partener 1

În această etapă a fost investigată hemocompatibilitatea derivaților polimerici. În acest scop, hemoliza și gradul de aglomerare al eritrocitelor au fost determinate pentru o serie de polimeri folosind tehnici binecunoscute pentru a obține plasmă-bogată-în trombocite (PRP).

De asemenea s-a efectuat o analiză a procesului de absorbție și acumulare intracelulară a conjugatelor de PiPOx-DOX asupra celulelor tumorale, pentru determinarea parametrilor optimi. Experimentele de distribuție intracelulară a conjugatelor și DOX liberă au ajutat în stabilirea parametriilor de achiziție.

Evaluarea în timp real a acumulării celulare a conjugatelor PiPOx-DOX și a eliberării de DOX indusă de variații ale pH-ului a fost efectuată prin achiziționarea de imagini la fiecare 30 de minute în câte 4 poziții pe o perioada de 72 ore pentru fiecare condiție experimentală, atât în contrast de fază, pentru observarea morfologiei celulare, cât și în epifluorescență pentru monitorizarea doxorubicinei acumulate.

S-a investigat capacitatea DOX liberă de a induce secreția/expunerea la suprafață a unora dintre semnalele de pericol asociate morții celulare imunogene, HSP70 și calreticulina, în linia celulară de limfoblaste T umane Jurkat. Concentrațiile de DOX liberă utilizate pentru a evalua moartea imunogenă au fost stabilite în experimentele preliminare realizate în etapa 2. Astfel, au fost selectate cele mai mici concentratii care, în urma tratamentului de 72 de ore, au determinat scăderea cu minim 50% a viabilității celulelor tumorale Jurkat.

Protocolul elaborat anterior a fost utilizat pentru a evalua capacitatea DOX eliberată din conjugatele polimerice PiPOx-DOX de a induce ICD. Celulele tratate cu PiPOx neconjugat au fost utilizate drept control negativ. Tratamentul celulelor Jurkat cu conjugat PiPOx-DOX a indus creșterea semnificativă a procentului de celule apoptotice care exprimă calreticulina la suprafață, precum și a secretiei de HSP70 după 48 de ore de tratament, similar tratamentului cu DOX liberă ceea ce indică faptul ca DOX eliberată din conjugatele polimerice poate induce moartea imunogenă a celulelor tumorale dar cu o cinetică diferită de internalizare și eliberare intracelulara comparativ cu DOX liberă.

Activitatea 3.1. Dezvoltarea sintetica a conjugatelor de PiPOx-DOX a fost perfectionata.

Activitatea 3.2. Testarea in vitro a stabilitatii, a eliberarii de medicament si studii de citotoxicitate a materialelor au fost investigate.

Activitatea 3.3. Studii de interactie a conjugatelor PiPOx-DOX cu celule tumorale au fost investigate.

Activitatea 3.4. Inducerea ICD a fost investigata.

Activitatea 3.5. Diseminarea pe scară largă prin comunicarea și publicarea națională sau internațională a rezultatelor efectuata cu succes.

 

Prezentare succintă a produsului dezvoltat

În cadrul proiectului experimental demonstrativ a fost dezvoltată o platformă inovativă de conjugate polimerice pentru tratamentul tumorilor, pe bază de (2-izopropenil-2-oxazolina) (PiPOx) și doxorubicină (DOX) ca agent chemo-imuno terapeutic, concept validat la nivel de laborator supus brevetării.

Prin intermediul obiectivelor și activităților desfășurate în cadrul proiectului experimental demostrativ, echipa multidisciplinară de specialiști a reușit să demonstreze versatilitatea și superioritatea conjugatelor de PiPOx-DOX ca sistem avansat de eliberare controlată a DOX la locul tumorii.

Modelul de conjugat polimeric dezvoltat aici a arătat o îmbunătățire a activității imune antitumorale și inducere de moarte celulară, totodată având o citotoxicitatea sistemică redusă față de DOX liberă.

Aceste model de conjugate polimerice ar putea ameliora sau chiar combate unele dezavantaje pe care le prezintă chimio-terapia în prezent, cum ar fi rezistența la tratament, dozaj mare de medicament și efecte adverse inerente.

Publications

1. Jerca, F.A.; Jerca, V.V.; Hoogenboom, R.; “In vitro assessment of the hydrolytic stability of poly(2-isopropenyl-2-oxazoline)”, Biomacromolecules 2021, 22 (12): 5020–5032, impact factor 6.988. https://doi.org/10.1021/acs.biomac.1c00994

2. D.E. Giol, V. Vasile, B. Palade, C.V. Tofan, I. Caras, C. Țucureanu, A. Salageanu, E. Ghibu, D.M. Vuluga, F.A. Jerca, V.V. Jerca, “In vitro evaluation of poly(2-isopropenyl-2-oxazoline) for injectable applications”, paper to be submitted.

 

Patents:

F.A. Jerca, V.V. Jerca, E. Ghibu, N.D. Banu, D.E. Giol, I. Caras, C. Țucureanu, C.V. Tofan, A. Salageanu, V. Vasile, B. Palade, CONJUGATE polimerice pe bazĂ de poli(2-izopropenil-2-oxazolinĂ) Și DOXORUBICINĂ pentru imuno-chimio-terapia cancerului și PROCEDEU DE OBȚINERE AL ACESTORA, cerere nr. A2022/00632 depus la OSIM cu data de deposit din 14.10.2022.

 

Conferences

1. E. Ghibu, N.D. Banu, C.V. Florea, D.E. Giol, V.V. Jerca, F.A. Jerca, “In vitro assessment of the chemical stability of poly(2-isopropenyl-2-oxazoline)”, 31st Edition of the international congress “PREPARING THE FUTURE BY PROMOTING EXCELLENCE”, Iași, România, 1–3 martie 2021. Poster online

2. V.V. Jerca, “Poly(2-isopropenyl-2-oxazoline)-smart polymeric material for advanced applications”, Zilele Academice Clujene - 2021, Cluj, România, 21 –22 octombrie 2021. Lecture

3. D.E. Giol, V. Vasile, C.V. Tofan, I. Caras, A. Salageanu, E. Ghibu, N.D. Banu, F.A. Jerca, V.V. Jerca, “In vitro toxicology study of poly(2-isopropenyl-2-oxazoline)s”, 32nd Edition of the international congress “PREPARING THE FUTURE BY PROMOTING EXCELLENCE”, 28 feb-2 mar 2022, Iași, România. Poster online

4. B. Palade, V. Vasile, C.V. Tofan, C. Țucureanu, E. Ghibu, N.D. Banu, F.A. Jerca, I. Caras, A. Salageanu, V.V. Jerca, D.E. Giol, “Preliminary toxicology studies of polyoxazolines intended for cancer imuno-theraphy”, 32nd Annual Conference of the European Society for Biomaterials, 4-8 September 2022, Bordeaux, France. Poster

5. V.V. Jerca, “Materiale Organice Inteligente: Când Chimia Organică Întâlnește Polimerii, Nanoștiința și Medicina”, Simpozionul 120 de ani de la nașterea Academicianului Costin D. Nenițescu, 22-23 Septembrie 2022, Academia Română, Bucuresti. Conferință orală

6. E. Ghibu, “Hidrogeluri Inteligente pentru Eliberarea de Compuși Biologic Activi” Simpozionul 120 de ani de la nașterea Academicianului Costin D. Nenițescu, 22-23 Septembrie 2022, Academia Română, Bucuresti. Comunicare orală